HPLC là gì? Ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc

Trong bài viết dưới đây, VCR sẽ đi sâu vào làm rõ khái niệm HPLC là gì cũng như ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc. Mời bạn đọc tham khảo để hiểu hơn về nguyên lý hoạt động cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kiểm nghiệm. Từ đó có thể giải mã lý do tại sao HPLC được ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thuốc hiện nay.

Tìm hiểu chung về HPLC

Trước tiên, VCR sẽ giải thích khái niệm HPLC là gì và nguồn gốc ra đời cũng như cấu tạo của phương pháp này.

HPLC là gì?

HPLC được biết đến là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, là chữ viết tắt của High Performance Liquid Chromatography. Trước đây, phương pháp này được biết đến một tên gọi khác là High Pressure Liquid Chromatography, có nghĩa là phương pháp sắc ký lỏng cao áp.

HPLC là một kỹ thuật tách chất để phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu thử từ đa lượng đến vi lượng. Chính vì vậy, phương pháp này được đánh giá có sự cải tiến vượt xa các loại kỹ thuật sắc kỹ cũ thông thường.

Nhờ phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể hóa phân tích để tách, nhận biết và định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Chính vì vậy, ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc là cực kỳ phổ biến.

Lịch sử hình thành của HPLC

HPLC được ra đời vào khoảng thời gian từ năm 1967 - 1968 nhờ cải tiến và phát triển từ phương pháp sắc ký cổ điển. Ban đầu, từ viết tắt HPLC được giáo sư Csaba Horváth đưa vào bài báo Pittcon năm 1970 với mục đích chỉ ra rằng áp suất cao được dùng để tạo nên dòng chảy qua cột sắc ký.

Trong thời kỳ trước đó, máy bơm chỉ có áp suất 500 psi và được coi là sắc ký lỏng áp suất cao. Mãi cho đến năm 1970, những thiết bị HPLC mới đã tạo ra bước tiến mới khi nâng áp suất lên 6000 psi với sự kết hợp của các kim tiêm mẫu, đầu dò và cột cải tiến.

Ngày nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ngày càng được cải tiến để trở nên hiện đại hơn dưới sự phát triển không ngừng nghỉ của ngành chế tạo máy phân tích.

Cấu tạo HPLC

Mỗi hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao thông thường sẽ có cấu tạo bao gồm:

• Bình chứa pha động: Một máy HPLC thường có chứa tới 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp để có thể sử dụng cả 4 bình chứa pha động cùng lúc với mục đích rửa giải theo tỷ lệ mong muốn.

• Bộ khử khí Degases: Có tác dụng loại trừ những bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Từ đó hạn chế tối đa tình trạng không đúng tỷ lệ pha động của các đường dung môi hoặc bơm cao áp không hút được dung môi ảnh hưởng tới tần suất và hoạt động của cả hệ thống gây sai lệch kết quả phân tích.

• Bơm cao áp: Thực hiện chức năng bơm pha động vào trong cột thực hiện quá trình chia tắc sắc ký và phải đảm bảo áp suất trong khoảng 250 đến 600 bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng đáp ứng từ 0.1 đến 10 ml/ phút.

• Bộ phận tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột phân tích bằng cách thủ công hoặc tự động.

• Cột sắc ký: Được chế tạo từ thép không gỉ với chiều dài 50 đến 300 mm và đường kính khoảng 2 đến 5 mm. Bên trong được nhồi đầy những hạt silica. Trong quá trình hoạt động, nhiệt độ pha động và cột tốt nhất được giữ ổn định.

• Đầu dò: Có khả năng phát hiện các chất khi chúng thoát ra khỏi cột sắc ký đồng thời hỗ trợ thực hiện định tính và định lượng. Tùy thuộc vào tính chất của mẫu thử mà chọn loại đầu dò phù hợp. Các loại đầu dò được sử dụng phổ biến hiện nay như máy UV-VIS, tán xạ bay hơi, huỳnh quang,…

• Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Được phần mềm trong hệ thống ghi nhận. Sau đó lưu thông số và sắc ký đồ rồi thực hiện tính toán và xử lý.

Nguyên lý hoạt động của HPLC

Nguyên lý hoạt động của HPLC dựa trên sự phân tách của các chất trong pha động và pha tĩnh dưới áp suất cao. Trong đó, pha động được dịch chuyển qua pha tĩnh và mang theo các thành phần hỗn hợp cần thực hiện phân tách.

Pha động

Pha động là dạng chất lỏng hoặc chất khí thích hợp, đáp ứng được yêu cầu phân tách. Tính chất bắt buộc của pha động là phải trơ với pha tĩnh và bền vững trong suốt quy trình chạy sắc ký. Đồng thời phải có độ tinh khiết cao, hòa tan được mẫu thử cần phân tích, có độ nhớt thấp và phù hợp với đầu dò. Được chia thành 2 loại cụ thể:

• Pha động có độ phân cực cao chủ yếu là nước, kết hợp thêm dung môi kém phân cực hơn nhằm giảm độ phân cực. Ví dụ như hỗn hợp nước kết hợp methanol, nước và Acetonitril,...

• Pha động có độ phân cực thấp có thành phần gồm các dung môi hữu cơ ít phân cực như n-Hexan, Toluen, Diclometan,... Thông thường sẽ có xu hướng phối hợp nhiều loại dung môi để tăng khả năng rửa giải và đáp ứng quá trình phân tích. Có thể thay đổi thành phần pha động theo thời gian với mục đích tách các hỗn hợp phức tạp hay còn gọi là rửa giải gradient nồng độ.

Pha tĩnh

Pha tĩnh được biết đến là các chất rắn ở dạng tiểu phân hoặc chất lỏng kết hợp với chất rắn, được nhồi trong cột để thực hiện quá trình tách các chất phân tích.

Phân loại HPLC chi tiết

Ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc còn tùy thuộc vào 4 loại chính như sau:

• Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao gồm 2 loại là pha thường (NP-HPLC) và pha đảo (RP-HPLC). NP-HPLC có pha tĩnh phân cực, ái nước và pha động ít phân cực, kị nước. Phạm vi chất ít và không phân cực, thường là chất hữu cơ. Có thể bị ảnh hưởng bởi độ ẩm; RP-HPLC có pha tĩnh ít phân cực và pha động dung môi phân cực và nước. Cơ chế hấp thụ trong phạm vi chất vô cơ, hữu cơ,... Có độ ổn định và lặp lại cao.

• Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao (IPE-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC) có pha tĩnh cấu tạo ion và bề mặt phân cực. Pha động nước, đệm pH, chất tạo phức. Cơ chế trao đổi ion trong phạm vi các dạng ion, phân ly thành ion, chất vô cơ, hữu cơ. Ưu điểm là độ ổn định và lặp lại tốt.

• Sắc ký phân bố hiệu năng cao (PC-HPLC) có pha tĩnh lỏng ít phân cực và pha động dung môi ít phân cực. Cơ chế phân bố các chất không phân cực, phân cực, chất vô cơ, hữu cơ… Độ ổn định và lặp lại kém

• Sắc ký rây phân tử hiệu năng cao (GEL-HPLC hoặc F-HPLC) có pha tĩnh cấu tạo loại NP-HPLC và RP-HPLC và pha động dung môi hữu cơ. Cơ chế rây trong phạm vi các chất phân tử lớn, >1000 đvC lĩnh vực polime.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kiểm nghiệm bằng phương pháp HPLC

Ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc là cực kỳ phổ biến. Tuy nhiên, cần phải nắm rõ các yếu tố quan trọng có khả năng ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chính xác dưới đây:

Pha tĩnh và pha động

Pha tĩnh, pha động là các yếu tố quan trọng có khả năng tác động mạnh mẽ đến quá trình sắc ký. HPLC có đảm bảo được diễn ra thuận lợi hay không phụ thuộc vào việc lựa chọn có lựa chọn được 2 pha thích hợp, đáp ứng yêu cầu tương thích với chất cần phân tích hay không. Sự ảnh hưởng của pha tĩnh, pha động đã được VCR thể hiện rất rõ ở nguyên lý hoạt động của quá trình sắc ký ở phần trên.

Lực tương tác

Trong quy trình chạy sắc ký, sẽ xuất hiện 3 tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh, chất phân tích với pha động và pha tĩnh với pha động. Các lực tương tác xuất hiện này sẽ quyết định thời gian rửa giải và tách ra khỏi nhau của mỗi chất có trong mẫu cần phân tích.

Trong đó, chất có tổng lực tương tác nhỏ nhất sẽ tách ra đầu tiên. Và, chất có tổng lực tương tác lớn nhất sẽ tách ra sau cùng. Đồng thời những chất có tổng lực tương tác bằng nhau hoặc xấp xỉ nhau thì không tách khỏi nhau được.

Mẫu phân tích

Thời gian lưu của một chất bị tác động rất nhiều từ cấu trúc của mẫu. Các yếu tố từ mẫu phân tích như loại cấu trúc, nhóm thế, độ lớn nhóm, vị trí nhóm thế, số nhóm thế và các dị tố của phân tử chất tan đều tác động đến ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc.

Thể tích nạp mẫu

Trong trường hợp mẫu vào cột với thể tích nhỏ hơn thể tích giới hạn thì lượng mẫu được nạp vào cột tăng và chiều cao cột cũng tăng theo sự tuyến tính.

Nếu mẫu nạp vào cột lớn hơn thể tích giới hạn thì chiều cao và lượng mẫu không có sự tuyến tính, có thể ảnh hưởng tới độ phân giải, thời gian lưu và chiều cao của đĩa H bị thay đổi.

Nhiệt độ

Nếu nhiệt độ tăng trong một giới hạn nhất định sẽ tạo điều kiện tốt hơn cho quá trình sắc ký như làm giảm độ nhớt pha động, thay đổi khả năng hấp phụ của pha tĩnh, tăng độ tan của chất và ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc của hệ.

Tuy nhiên cần lưu ý là không phải trường hợp tăng nhiệt độ nào cũng giúp cải thiện hiệu quả của quá trình sắc ký. Vậy nên cần thực hiện khảo sát một nhiệt độ phù hợp.

Thực tế ứng dụng của HPLC trong ngành dược

Ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc nói riêng và trong ngành dược nói chung đã được chứng minh là hữu ích. Các loại HPLC rất đa dạng nên tùy vào nhu cầu nghiên cứu mà có chọn lựa phù hợp.

Ứng dụng HPLC vào chẩn đoán lâm sàng

Trong sản xuất dược phẩm sinh học, việc phân tích tiền chất và các chất chuyển hóa của Catecholamin rất quan trọng vì chúng có thể giúp chẩn đoán các bệnh như bệnh parkinson, bệnh tim và loạn dưỡng cơ.

Tuy nhiên đặc tính của chất này là dễ lan rộng nên việc phân tích và kết luận về sức khỏe bệnh nhân phải được thực hiện cẩn thận. Ứng dụng HPLC vào chẩn đoán lâm sàng có khả năng phân tách và so sánh các phân tử với cường độ cao hơn các kỹ thuật khác.

Đó chính là lý do khiến cho HPLC trở thành phương pháp chẩn đoán lý tưởng hiện nay. Tất nhiên yếu tố mẫu sẽ quyết định phần nhiều đến độ chính xác khi cho ra kết quả.

Ứng dụng HPLC vào sản xuất dược phẩm

HPLC được ứng dụng vào sản xuất dược phẩm với mục đích xác minh độ tinh khiết của thuốc trên toàn cầu.Phương pháp này sẽ cho hiệu quả tối ưu nhất khi được thực hiện trước các thử nghiệm hiệu chuẩn, từ đó cung cấp độ chính xác và độ đặc hiệu cao.

So với phương pháp kết tinh nhiều lần thường được sử dụng trước đây đòi hỏi các loại thuốc đắt tiền để phân tích thì HPLC được đánh giá mang lại hiệu quả hơn nhiều. Trong thực tế, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao còn được ứng dụng phân tích các alcaloid, kháng sinh và steroid và tách các hợp chất. Ngoài ra, còn có khả năng chứng minh độ tinh khiết của các phân tử enantiomeric.

Xem thêm: Phòng sạch trong sản xuất dược phẩm

Ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc

VCR làm rõ ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc chi tiết dưới đây:

Ứng dụng để kiểm tra sự có mặt của một chất trong mẫu thử

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để tách các thành phần và tiến hành thực hiện quá trình phân tích sau đó. Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ và thời gian lưu trong một điều kiện sắc ký, người kiểm nghiệm dễ dàng xác định được sự có mặt của một chất trong mẫu phân tích.

Ứng dụng với mục đích phân tích các chất trong mẫu

HPLC được sử dụng phổ biến trong ngành dược để phân tích các thành phần có trong mẫu như chất đa lượng là các chất độc hại, phụ gia, chất bảo quản, các vitamin, kháng sinh….; các độc tố sinh học, các mẫu sinh học; các tạp chất, độc tố trong dược phẩm,..

Ứng dụng trong quá trình điều chế và sản xuất

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được áp dụng để tách chất và điều chế các chất có trong dược liệu. Vậy nên có thể ứng dụng trong điều chế sản xuất bằng cách tách các tạp chất ra khỏi thuốc. Hoặc, có thể tách protein ra khỏi các thành phần nội sinh trong các vật liệu sinh học.

Vì sao phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thuốc?

Dưới đây là các lý do khiến việc ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc ngày càng trở nên phổ biến hiện nay:

• Phương pháp này có khả năng phân tách được đa dạng các loại chất khác nhau từ đó dễ dàng áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành và nhiều lĩnh vực.

• Sở hữu độ chọn lọc, độ nhạy cũng như khả năng định lượng rất tốt với độ chính xác cao.

• Tính tiện lợi cao và dễ dàng ứng dụng.

• Có độ tương thích cao khi sử dụng với nhiều chất khác nhau, đặc biệt là các chất có khả năng bay hơi kém hay các loại chất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao.

Tài liệu tham khảo

Các thông tin về ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc được VCR chia sẻ trên đây đều được tham khảo chi tiết tại:

• Tài liệu Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.

• Tài liệu Kiểm nghiệm Dược phẩm, Nxb Y học, Hà Nội.

• Tài liệu Jared L.Aderson et al (2015), 5 Volume Set.

Với các chia sẻ về nguyên lý hoạt động, các yếu tố tác động và ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm thuốc trên đây, VCR mong rằng sẽ giúp bạn đọc tiếp cận gần hơn các kiến thức hữu ích về kiểm nghiệm thuốc trong thực tế.